Ara

Bu bölümde sistem içerisindeki makaleler arasında arama yapabilirsiniz.

Dergi Kimliği

Online ISSN (İngilizce)
1305-3124

Basılı ISSN (Türkçe)
1300-5251

Online ISSN (Türkçe)
1305-3132

Kuruluş
1993

Editör
Cihat Şen

Yardımcı Editörler
Murat Yayla, Oluş Api, Resul Arısoy

Türk toplumunda sık görülen kalıtsal hastalıklarda PCR tekniğine dayalı DNA tanı yöntemlerinin geliştirilmesi ve servis olarak sunulması

Sibel Kantarcı, Serpil Eraslan, K. Yahya Laleli

Künye

Türk toplumunda sık görülen kalıtsal hastalıklarda PCR tekniğine dayalı DNA tanı yöntemlerinin geliştirilmesi ve servis olarak sunulması. Perinatoloji Dergisi 1999;7(1):15-22

Yazar Bilgileri

Sibel Kantarcı,
Serpil Eraslan,
K. Yahya Laleli

  1. Düzen Laboratuvarlar Grubu, Moleküler Genetik Bölümü, İstanbul-Türkiye
Yayın Geçmişi

Yayınlanma Tarihi: 15 Mart 1999

Çıkar Çakışması

Çıkar çakışması bulunmadığı belirtilmiştir.

Genetik hastalıklar, dünyada olduğu kadar, ül­kemizde de önemli bir sağlık sorunudur. Bu tür hastalıkların, bireylerle sınırlı kalmayıp, kuşak­tan kuşağa aktarılma riskinin olması ve çoğunun kesin tedavisinin bulunmaması, bu sorunun temel nedenlerini oluşturur. Klinik olarak tanımlanmış genetik hastalıkların topluma ve hasta ailelerine getirdiği maddi ve manevi yük ise küçümsenmeye­cek boyuttadır. Bununla birlikte, kalıtım şeklinin bilinmesi, ailede olası ve kesin taşıyıcıların saptan­ ması ve doğacak olan çocukta aynı hastalığın orta­ ya çıkıp çıkmayacağının araştırılması, özellikle ke­ sin tedavisi olmayan hastalıkların önlenebilmesi için günümüzde izlenebilecek tek yoldur. Genetik hastalıklar, bireyin kalıtım materyalin­de meydana gelen kalıcı olumsuz değişiklikler ile ortaya çıkar. Bu değişiklikler, sitogenetik yöntem­lerle tespit edilebilen, yapısal veya sayısal kromozom anomrinin yanı sıra, alilesadece moleküler DNA analiz sistemleri ile tespit edilebilen ekson delesyon/duplikasyon, mikrodelesyon/duplikasyon, substitüsyon, inversiyon, insersiyon gibi mutasyonlardan kaynaklanabilir

Anahtar Kelimeler

Giriş
Genetik bilimindeki bilgilerin her geçen gün artması, kalıtım materyalinin kolay incelenmesini sağlayan güçlü teknoloji­ lerin gelişmesini sağlamaktadır. Bu gelişmeler çer­çevesinde, dünyada, bu tür hastalıklardan etkile­nen bireyler ve ailelerine yardımcı olmak amacı ile, genetik danışma merkezleri ve genetik laboratuvarları kurulmaktadır. Ülkemizde de, genetik analiz sistemlerinin üniversitelerin araştırma grup­ları tarafından etkin olarak kullanılır hale getirilme­si ile birlikte, genetik tanı yöntemlerinin servis olarak sunulması konusunda önemli adımlar atılmak­tadır.
Türkiye de sık görülen kalıtsal hastalıklar için etkili bir moleküler DNA analiz programının oluş turulması amacı ile, Boğaziçi Üniversitesi Biyoloji Bölümü* ve Düzen Laboratuvarlar Grubu 1993 yı­lında ortak bir proje başlattı. Proje, üniversite laboratuvarında kullanılan rutin DNA analiz yöntemle­rinin, ülkemizde ilk defa özel bir laboratuvar bün­yesinde uygulanmasını sağladı. Proje süresince, Duchenne/Becker kas distrofisi (DMD/BMD), he­ mofili A, hemofili B, kistik fibroz (CF), |}-talasemi ve orak hücre anemisi (SCA) hastalıklarında, polimeraz zincir reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction : PCR) tekniğine dayalı DNA tanı yöntemleri ile ilgili uygulamaların aktarılması ile, İstanbul Düzen Laboratuvarı Moleküler Genetik Bölümü kuruldu. 1996 yılında sonlanan proje döneminden sonra bö­ lümümüz, sırası ile, Faktör V Leiden, Spinal Müsküler Atrofi (SMA), ve akondorplazi (ACH) hasta­ lıklarını da çalışma kapsamına aldı. Şubat 1996-Şu- bat 1999 tarihleri arasında 76 faktör V Leiden, 73 P-talasemi, 46 CF, 42 DMD/BMD, 9 hemofili A, 9 SMA, 4 SCA, 3 hemofili B ailesi olmak üzere top­lam 266 aile mutasyon belirleme veya bağlantı ana­lizi isteği ile bölümümüze başvurdu. Çalışma süre­ since, prenatal tanı isteyen 31 aileye toplam 33 prenatal tanı verildi.
Bölüm, mevcut çalışmalarının yanı sıra, Kasım 1998 tarihinden itibaren araştırma çalışmalarınada başladı. Bu çalışmalar arasında, rutin DNA analiz­leri sonucunda mutasyon bulunamayan ailelerde, bilinmeyen mutasyonlann araştırılması için uygun DNA analiz tekniklerinin geliştirilmesi ve Infantil polikistik böbrek hastalığı (otozomal resesif poli- kistik böbrek hastalığı; ARPKD) ailelerinin haplotip analizi yer almaktadır .

AMAÇ VE UYGULAMA

İstanbul Düzen Laboratuvarı Moleküler Genetik Bölümü'nün amacı, Türkiye'de sık görülen kalıtsal hastalıklar için etkili bir moleküler tanı programı uygulamaktır. Bu uygulama sırasında göz önünde bulundurulması gereken ve üç ana başlık altında toplayabileceğimiz kriterler vardır.
1• Hasta kabul işlemleri : Aile, çalışma için ka­ bul edilmeden önce, tanıyı koyan ve aileyi bize gönderen doktor ve/veya merkez ile görüşülerek, aile ağacı, hasta birey ve gerek tiği durumlarda diğer aile bireylerinin klinik/laboratuvar bulguları ile ilgili bilgilerin alınması.
2 • Çalışma planının belirlenmesi: Çalışma şekli (mutasyon tespiti ile tanının doğrulanması, direkt veya indirekt yöntemler ile taşıyıcılık tanısı veya prenatal tanı) belirlenmelidir. Mutasyon ve polimorfizmlerin analiz metodları ve süreleri farklı olabilir. Buna bağlı ola­ rak analiz bitiş süresi belirlenir.
3 • Sonuç bildirme : Analiz sonuçları ile ilgili ra­ por hazırlanarak, aileye herhangi bir yorum yapılmadan, ilgili doktor ve/veya merkeze iletilir. Kalıtsal hastalıkların tanısında kullanılan DNA analiz tekniklerinin uygulanması sırasında, analizi yapılan hastalık ile ilgili genetik mekanizmaların iyi bilinmesinin önemi büyüktür. Bölümümüzde çalışılan kalıtsal hastalıkları, kalıtım patemlerine göre üç grupta toplamaktayız.
A. Otozomal Resesif Kalıtım Gösteren Has­ talıklar : Somatik kromozomlar üzerinde bulunan ve resesif kalıtım paterni gösteren genler yolu ile, bir kuşaktan diğerine aktarılırlar. Cinsiyet kromozomları üzerinde olmadıkları için, hastalık fenotipi-nin ortaya çıkma olasılığı, kız ve erkek çocuklarda eşittir. Taşıyıcı bir anne babadan olacak bütün ço­ cukların %25 inin hasta, %50 sinin ise taşıyıcı olma riski vardır. Hastalığa neden olan mutasyonların çeşitleri ve görülme sıklıkları etnik farklılıklar gös­terebilir. Akraba evlilikleri, bu tür hastalıkların or­taya çıkma olasılığını arttıran, önemli bir faktördür.
Kistik Fibroz (CF): CF beyaz ırkta sıklıkla rastlanan ve otozomal resesif geçiş gösteren en ciddi kalıtsal hastalıklardan biridir. CF, tüm etnik gruplarda ve coğrafik bölgelerde görülür. Kuzey Amerika ve Kuzey Avrupa popülasyonlarında daha sık rastlanır. Bu popülasyonlarda her 1900-3700 kişiden bir tanesi CF'lidir ve her 25 kişiden birisinin CF taşıyıcısı olduğu bilinmektedir.Kistik fibroz dış salgı bezlerinde klor iyonu taşınmasını düzen­ leyen "kistik fibroz hücre zarından geçiş düzenle­ yici protein" (cystic fibrosis transmembrane con-ductance regulatory protein : CFTR) olarak bilinen proteinin yapısal bozukluğundan kaynaklanır. Has­ talığa, 7q31-32 kromozom bölgesine lokalize olan CFTR geninde meydana gelen değişik mutasyonlar neden olur. CFTR geni üzerinde şimdiye kadar 700'den fazla mutasyon tespit edilmiştir.
Hastalık belirtileri tüm dış salgı bezlerinde gö­rülür. Kronik akciğer hastalıkları, pankreatik dış salgı yetersizliği gibi belirtilerin yanı sıra, etkilen­miş bireylerin ter elektrolit değerleri oldukça yüksektir.
Son yıllarda yapılan çalışmalar, infertilite olgula­ rında, özellikle CBAVD (conjenital bilateral absense of vas deferens) vakalarının büyük bir bölümün­de, durumun CFTR geninde meydana gelen mutas­ yon ve/veya varyasyonlardan kaynaklandığını or­taya koymuştur .
CF, Türk toplumunda da sık görülen bir hasta­ lıktır. Toplumumuzda, bugüne kadar tespit edilen 20'ye yakın mutasyondan en sık görüleni, yaklaşık %16'hk bir frekans ile, (F508 dir).
B-talasemi : Hemoglobin (Hb) iki a ve iki b-globin zincirinden oluşan tetramerik bir proteindir. Akdeniz anemisi veya Cooley anemisi olarak bili­nen p-talasemi, P-globin zincirinin sentezlenmesi veya yetersiz sentezlenmesi sonucu ortaya çıkan bir hemoglobinopatidir. Akdeniz kıyılarındaki ülkelerden başlayarak uzak doğuya kadar uzanan kuşak içinde bulunan ülkelerde (İtalya, Yunanis­ tan, Hindistan, Güney Çin gibi) çok sık görülür. Hastalığın ortaya çıkmasına, 11. kromozomun kısa kolu üzerine lokalize olan P-globin geninde mey­ dana gelen mutasyonlar neden olur. Dünyada bu­ güne kadar belirlenmiş 180'den fazla P-talasemi mutasyonu vardır.
b-talaseminin kesin tedavisi olmadığı için taşıyı­ cıların belirlenmesi önemlidir. Buna yönelik olarak yapılan kan sayımında ortalama eritrosit hacmi (MCV) ve ortalama eritrosit hemoglobini (MCH) değerlerinin düşmesi, periferik yaymada mikrosi-toz görülmesi ve hemoglobin elektroforezi sonu­ cunda HbA 2 değerinde görülen artış, önemli kriter­ lerdir. Taşıyıcı olduğu belirlenen ebeveynlerde ya­ pılan moleküler analiz, taşıyıcılık genotipini çoğu zaman ortaya koyar ve dolayısı ile, prenatal tanıya olanak sağlar.
Türkiye genelinde, hastalık geninin frekansı or­talama %2'dir; fakat bu frekans bölgesel farklılık gösterebilir. Genetik araştırmalar, çok değişik etnik grupların bir arada yaşadığı ülkemizde şimdi­ ye kadar 40'ın üzerinde mutasyon olduğunu gösterdi. Bu mutasyonlardan en sık görülen IVS-I- 110'un frekansı toplumumuz için %40.1'dir . /î-globin geninde meydana gelen mutasyonlar­dan kaynaklanan ve b-talasemi çalışmaları sırasında incelenen diğer hemoglobinopatiler, hemoglo­bin S (HbS) ve hemoglobin C (HbC) dir.
Orak hücre anemisi (SCA; HbS) : /î-globin zincirinin yapısal değişikliği sonucu ortaya çıkan bir hemoglobinopatidir. Eritrosit morfolojisinin bozu­larak orak şeklini almasına neden olur. Bu eritrositler mikrosirkülasyonda vazos-oklüzyon ve kro­nik hemoliz meydana getirirler. Hasta veya taşıyıcı­larda, HbAl değeri düşük ve HbS değeri yüksektir. HbS fenotipine, p-globin zincirinin 6. amino asidi olan glutamik asitin valine dönüşmesine neden olan bir nokta mutasyonu yol açar.
Hemoglobin C (HbC): Dünyada HbS'ten sonra en sık görülen hemoglobin varyantıdır. Eritrositler de kristalleşen yapıların oluşmasına sebep olur ve homozigot HbC veya HbC/p-talasemi birleşik heterozigotlarda anemi durumu ve dalak büyümesi oluşur. HbC fenotipine, p-globin zincirinin 6. ami no asiti olan glutamik asitin lizine dönüşmesine neden olan bir nokta mutasyonu yol açar .
Spinal müsküler atrofi ÇSMA) : Omurilikte bulunan anterior boynuz hücrelerinde meydana gelen bir hastalıktır. Bu hastalar yürüme, baş ve boynu sabit tutma, yutma gibi istemli kas hareket­lerini güç yaparlar. Klinik olarak belirlenmiş üç ti­pi vardır:
• SMA Tip I (Werdnig-Hoffmann Hastalığı): SMA'nın en ağır formudur. Etkilenmiş bireylerin çoğu doğumlarını takip eden ilk altı ay içinde, bir kısmı da iki yaş öncesi ölürler .
• SMA Tip II : SMA'nın kronik formudur. Etki­ lenmiş bireyde belirtiler iki yaşından önce başlar ve tanı bu yaşlarda rahatlıkla konulabilir. Yürüme­ yi öğrenmeleri mümkündür fakat zayıf göğüs kas ları yüzünden çabuk yoaılurlar.
• SMA Tip III (Kugelberg-Welander Hastalığı): SMA'nın hafif formudur. Belirtiler, iki yaş civarında ortaya çıkabileceği gibi, daha ileri yaşlarda da gö­ rülebilir.
SMA hastalarının çoğu, hayatlarının ilerleyen yıllarında solunum yolu yetersizliği veya enfeksi yonlarına bağlı komplikasyonlar yüzünden hayat­ larını kaybederler.
Özellikle SMA tip II ve III hastalarında, kreatin fosfokinaz (CPK) değerlerinin serumda yükselmesi, elektromyografi (EMG) ve kas biyopsi sonuçla­rı hastalık tanısını destekleyen önemli kriterlerdir.
Moleküler çalışmalar, SMA fenotipi ile bağlantı­lı görülen ve 5ql 1.2-13.3 kromozom bölgesine haritalanan 500 kilobazlık (kb) bir DNA bölgesinin, invertduplike halde bulunduğunu gösterdi.1995 yılında bu bölgeden birkaç gen izole edildi. Bunlardan bir tanesi "survival motor ne- uron" (SMN) denilen, birbirine yüksek homoloji gösteren sentromerik (SMNc) ve telomerik (SMNt) iki kopyası olan gendir. SMA hastalarının %97'sinin SMNt geninde homozigot ekson delesyonları görülür. SMNc'de meydana gelen delesyoların hastalık fenotipine etkisi olmadığı düşünülmektedir. İzole edilen bir diğer gen, "neuronal apoptosis inhibitory protein" (NAİP) geni olarak isimlendirilir. SMA tip I hastalarının %67'inde, SMA tip II ve III hastalarının %24'ünde NAİP geni­ne ait ekson delesyonları tespit edilmiştir. Dünya­ da,SMA hastalığının moleküler mekanizması ile il­gili araştırmalar devam etmektedir Türk toplumunda yapılan çalışmalarda SMNt delesyon frekansının %85-90 arasında olduğu tes pit edildi.
Faktör V Leiden : Aktive protein C (APC), antikoagulant özelliğe sahip bir serin proteazdır.Normal hemostaz sırasında APC factör Va ve VlIIa'nın proteolitik inaktivasyonunu sağlayarak kanın pıhtılaşmasını sınırlar. Tromboz hastalarının yaklaşık %50'sinde, APC antikoagulant cevaba karşı bir rezistans olduğu bilinmektedir (APC rezistans). APC rezistans fenotipinin, büyük oranla faktör V geninde meydana gelen bir nokta mutasyonuna (1691 G-»A substitüsyonu; FVQ506) bağlı olduğu bulunmuştur,. Faktör V Leiden olarak isimlen­ dirilen bu mutasyonu homozigot veya heterozigot olarak gösteren bireylerde APC rezistansına bağlı tromboz olaylarının fazla olduğu bilinmektedir.
5. İnfantil Polikistik Böbrek Hastalığı (ARPKD) : Otozomal resesif-polikistlk böbrek hastalığı (ARPKD), en genel kalıtsal renal kistik hastalıklarından biridir. Rapor edilen insidansı can­lı doğumlarda 1:6.000 (Amerika raporlarında)-1:40.000 (Avrupa literatürlerinde)'dir. Tüm veriler dikkate alınınca muhtemel insidans canlı doğum­ larda l-2:10.000'dir. ARPKD, birçok çocuk vakada ölüme sebep ol­duğu için, hasta çocuğu olan ailelerde prenatal tanıya büyük bir istek vardır.
ARPKD'in fetal ultrason ile prenatal tanısı (hatta doğumda oldukça genişlemiş böbreğe sahip vakalarda bile) genellikle 22. gebelik haftasından önce mümkün değildir. Hafif manifestasyonu olan vakalarda ultrason ile prena­tal tanı imkansız olabilir. ARPKD lokusunun öp'nin proksimaline haritalanması, riskli ailelerde haplotipe dayalı prenatal tanıya imkan verdi. Bu has talıktan sorumlu olan gen henüz klonlanmadığı için taşıyıcılık tanısı ve prenatal tanıda henüz mutasyon analizi yapılamamaktadır. Prenatal tanı iste­ yen aielelerde başvurunun kabulü için gereken kriterler;
• Karakteristik ultrasonografik işaretli tipik kli­nik işaretlerin manifestasyonu
• Aşağıda belirtilen kriterlerden en az birinin varlığı, ebeveynlerde ultrason incelemesi sonu­ cunda renal kistin olmayışı-hepatik fibrozun klinik işaretleri veya histopatolojik kanıtı en az bir hasta kardeşte ARPKD'in patho-anatomik kanıtı ebeveynlerin akraba olması.
B. Otozomal Dominant Kalıtım Gösteren Hastalıklar: Somatik kromozomlar üzerinde bulu nan ve dominant kalıtım paterni gösteren genler yolu ile, bir kuşaktan diğerine, cinsiyet farkı gözet­ meksizin aktarılırlar. Mutasyonun hem homozigot hem de heterozigot formlarında hastalık görülür. Homozigot mutant bireylerde klinik tablo daha ağırdır. Her iki ebeveynin heterozigot olduğu du­ rumlarda, çocukların %25'nin homozigot mutant,%50'sinin ise heterozigot olma riski vardır. Ebe­ veynlerden sadece birinin heterozigot olması duru­munda, çocukların %50'sinin heterozigot olma riski vardır.
Akondroplazi : Kemik gelişiminde meydana gelen aksaklıklara bağlı olarak ortaya çıkan cüce­ liktir. Hastalığın, doğumda klinik ve radyolojik ola­ rak rahatlıkla tanısı konulur. Hastalık, kısa ekstremiteler, çıkık bir alın ve basık burun köküne sahip büyük bir baş ve iskelet sistemi anomalileri ile karekterize edilir. Hastalığın görülme frekansı bütün toplumlarda yaklaşık 1/26000'dir. Akondrop­ lazi vakalarının yaklaşık %95'inde olaya, 4pl6.3 kromozom bölgesine lokalize olan, fibroblast bü­yüme faktör reseptörü-3 (FGFR-3) geninde meyda­na gelen bir mutasyon (1138G ® A substitüsyonu) yol açar. Özellikle, homozigot mutant bireylerde klinik tablonun çok ağır seyretmesi ve doğumdan bir süre sonra ölümle sonuçlanması, moleküler dü­ zeyde prenatal tanının önemini arttırır.
C. X'e Bağlı Resesif Kalıtım Gösteren Hasta­lıklar: X kromozomu üzerinde bulunan ve resesif kalıtım paterni gösteren genler yolu ile, taşıyıcı an­ neden erkek çocuğa aktarılırlar. Bazı durumlarda, hastalık anne taşıyıcı olmadığı halde ortaya çıkabilir. Taşıyıcı bir anneden doğacak olan erkek çocu­ğun etkilenmiş olma ihtimali %50'dir. Kız çocukla­rı ise aynı oranda hastalığın taşıyıcısı olabilirler. Ak­raba evliliklerinin hastalığın ortaya çıkma frekansı­na etkisi yoktur. Hastalığa sebep olan mutasyonlann çeşitleri ve frekansları çoğu zaman etnik farklı­lıklar göstermez.
Duchenne/Becke Kas Distrofisi (DMD/BMD): DMD/BMD, kas hücrelerinin iç membran yapısında bulunan distrofin proteininin yapısal bozuklarından kaynaklanan bir kas hastalı­ ğıdır. Distrofin proteininin fonksiyonu, yapısal özellikleri ve diğer proteinler ile olan ilişkileri konularında yapılan çalışmalar hala devam etmekte­dir. Bununla birlikte, araştırmalar, bu proteinin ek­sikliğinin, kas hücre membranının stabilitesini boz­duğunu göstermektedir. Buna bağlı olarak tahrip olan kas dokusu, zamanla yerini yağ dokusuna bı­rakır. Her 3300 erkek doğumda bir görülen DMD, ağır bir fenotipe sahiptir. Hastalık belirtileri 2-5 yaş arasında, yürüme, merdiven çıkma, oturup kalkmada güçlük ile başlar ve zaman içinde daha da ağırlaşır. Etkilenen bireyler 18-20 yaş arasında kalp veya akciğer yetmezliğine bağlı komplikasyonlar sebebi ile ölürler.
Hasta serumunda, kreatin fosfokinaz (CPK) ve laktik dehidrogenaz (LDH) değerlerinin yükselme­si, elektromyografi (EMG) ve kas biyopsi sonuçla­ rı hastalık tanısını destekleyen önemli kriterlerdir.
BMD ise, DMD nin allelik, hafif bir formudur ve daha ender görülür. Hastalığa, distrofini kodlayan ve Xp21 kromozomuna lokalize olmuş gen bölge­sinde meydana gelen mutasyonlar sebep olur. Ol­guların, %50-60'ında hastalık etkeni olan mutas­ yon, ekson delesyonlarıdır . Duplikasyonlar vakaların sadece %6'sında görülür. Geri kalan durumlarda hastalık etkeni nokta mutasyonlarıdır. DMD/BMD mutasyon çeşitleri ve frekansları etnik varyasyon göstermez.
2.5 mega bazçiflik (Mbç) uzunluğu ile, distrofin geni insan genomunun, bugüne kadar izole edil­miş olan en büyük genidir. Bu özelliği dolayısı ile gen içi rekombinasyon riski oldukça fazladır. İndirekt analiz (bağlantı analizi) kullanımı sırasında, re­kombinasyon olasılığı, göz önünde bulundurulma­sı gereken faktörlerden biridir.
Hemofili A ve Hemofili B : Her iki hastalık gaıbunda da, kanın pıhtılaşmamasına bağlı olarak hayati komplikasyonlar meydana gelir. Hemofili A, pıhtılaşma zincirinde rolü olan ve Xq28 kromozom bölgesine lokalize genin kodladığı faktör VIII pro­teinine, hemofili B ise yine aynı zincirde fonksiyonel olan ve Xq27 kromozom bölgesine lokalize ge­ nin kodladığı faktör IX proteinine ait gen bölgele­ rinde meydana gelen mutasyonlardan kaynaklanır. Toplumda görülme frekansları, sırası ile, 1/5000-10000 ve 1/30000'dir. Her ikisinde de sap­ tanmış mutasyonlar olmasına karşın ilginç bir şekil­ de bu mutasyonların aileye özel olduğu anlaşılmış dolayısı ile hastalarda direkt mutasyon analizi ile tanıya gidilmesi zorlaşmıştır. Dolayısı ile, şu anda bu hastalıklar için araştırma bazında uygu­ lanan mutasyon tarama tekniklerinin dışında, rutin olarak en sık uygulanan metod, gen içi ve gen dı­şı markörler kullanılarak yapılan bağlantı analizidir.
Bununla birlikte, hemofili A olgularında ağır fe­notipe yol açan, faktör VIII geninin 22. intron böl­gesinin (İnt22h) inversiyon mutasyonuna oldukça sık rastlanmaktadır.
Bütün bu hastalıklarda, mutasyonun. belirlendi­ ği durumlarda taşıyıcılık tanısı ve prenatal tanı %100 kesinlikle verilebilir. Bununla birlikte ailede kalıtılan mutasyon tespit edilememişse, taşıyıcılık tanısı ve prenatal tanı ancak bağlantı analizi ile ya pılabilir.
Bölümümüzde çalışılan bütün hastalıklarda, analizini yaptığımız mutasyonların ismi, her bir mutasyonun toplum frekansı ve analiz yöntemleri Tablo l'de verilmiştir. Mutasyon tespit edilemeyen ailelerde yapılan bağlantı analizi sırasında kullanı­ lan markörlerin isimleri ise Tablo 2'de yer almakta­ dır.
Kalıtsal hastalıkların moleküler tanısında kullanılan teknikler
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) DNA'nın bir bölümünü in vitro ortamda çoğaltıp, manuple edi lir hale getirmek için kullanılan hızlı bir yöntemdir. PCR'ın kullanım alanı gittikçe artmaktadır. Bu yön tem, genetik hastalıklarda, DNA'da mevcut mutas mıştır. Bu bölgelere hot-spot bölge denilir.
a. Çoklu gen amplifikasyon sistemleri, hot-spot bölgesi için­ de bulunan 9 ekson bölgesinin çoğalmasını sağla­ yan iki setten oluşur. Normal bireylerde 9 bölgenin amplifikasyonu beklenir. Delesyonlu bireylerde ise, delesyonlu bölge/bölgeler amplifikasyon nega­ tif görülür.
b. ARMS (Allel Refractory Mutation System) PCR: Herhangi bir restriksiyon enzim ke sim bölgesi değişikliğine neden olmayan nokta mutasyonlarının tanımlanmasında yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Hasta bireye ait DNA ör neği, mutasyonlu ve normal bölgeye özgü primer ler ile iki farklı tüpte, aynı reaksiyon koşulları altın da amplifiye edilir. Ayrıca, her iki reaksiyon tüpü nün içinde, amplifikasyon kontrolü için kontrol primerler kullanılır. Amplifikasyon sonucu, kontrol bölgenin tüm bireylerde amplifikasyon pozitif ol ması beklenir. Bununla birlikte, homozigot mutant bireyler, mutant bölge için amplifikasyon pozitif; homozigot normal bireyler, normal bölge için amplifikasyon pozitif ve heterozigotlar hem mutant hem de normal bölge için amplifikasyon pozitif olurlar.
c. ASA (Allele Specific Atnplification ; Allele Özgü Amplifikasyon): Yöntemin temeli, mutasyonun bulunduğu bölgeye özgü, ya da bir başka deyiş ile, allele özgü primer kullanmaya dayanır. Ayrıca, amplifikasyonun kontrolü için kontrol primerleri kullanılır. İncelenen örnek mutasyonu taşı­ yorsa, hem kontrol bölge hem de mutasyona özgü bölge için amplifikasyon pozitif görülür; mutasyo­ nu taşımıyor ise, sadece kontrol bölge için amplifi­ kasyon pozitiftir. Heterozigot bireylerde, allellerden birinde mev­ cut olan mutasyon sebebi ile, homozigot mutantlarda olduğu gibi, her iki bölge için amplifikasyon pozitif görülür.
2. PCR ürününün değişik işlemlerden geçi­ rildikten sonra incelenmesi
a. REA (Restriksiyon Enzim Analizi) : Tek bir baz çiftinin değişimi ile oluşan bir mutasyon restriksiyon enzim bölgesinin ortadan kalkmasına veya yeni bir kesme bölgesi oluşmasına neden ola­ bilir. Restriksiyon enzim analizi ile tespit edilebilen mutasyonun saptanmasında kullanılan yaklaşım, mutasyonun bulunduğu bölgenin PCR ile çoğaltıl­ması ve çoğaltılan DNA'nın mutasyona özgü rest­ riksiyon enzimi ile kesildikten sonra analiz edilmesinden ibarettir.
b. Heterodupleks oluşum analizi ; 1-5 nük leotidlik delesyon mutasyonunu jel üzerinde sapta­mak oldukça güçtür. Fakat homozigot normal ve mutant bireylere ait DNA örnekleri, aynı tüp içinde amplifiye edildikleri takdirde, heterodupleks denilen yapıları oluştururlar. Heterodupleksler, tam uyuşmayan baz çiftlerinin varlığı nedeni ile homo-duplekslere kıyasla farklı bir elektroforetik özellik gösterir
c. RDB (Reverse dot blot) (fi-globin strip assay; Vienna-Lab) : Kit, 14 ayrı mutasyonun kısa sürede taranmaqsını sağlamaktadır. Kite ait pro-sedür içinde DNA ekstraksiyonu, PCR, hibridizas-yon ve renklendirme reaksiyonu yer almaktadır. Kitten çıkan DNA ekstraksiyon çözeltileri kullanıla-rak elde edilen genomik DNA, yine kitin içinde bu-lunan PCR amplifikasyon mixleri ile karıştırılarak PCR multipleks reaksiyonuna sokulur ve reaksiyon sonucu biyotinlenir. Sonuç olarak PCR ürünü strip üzerinde bulunan immobilize mutant ve normal oligonükleotid problar ile hibridize edilir. Bağlanan biyotinli diziler streptavidin-alkalen fosfataz ve renklendirme substratları kullnılarak belirlenir. Hastaya ait DNA'da taranan mutasyonlardan biri var ise analiz sonucunda strip üzerinde mevcut mutant prob bölgesinde bir renk belirir. Normal probların bağlı olduğu bölgelerde ise mutasyonsuz normal alleller bağlanır.
B. İndirekt Analiz (Bağlantı Analizi) : Bu analiz mutasyonun tespit edilemediği durumlarda aile içinde anne/anne+baba ve hasta çocuk arasın­daki allel geçişlerinin belirlenmesine dayalıdır. Bu­nun için RFLP ve/veya VNTR markörleri kullanılır. c. RDB (Reverse dot blot) (fi-globin strip assay; Vienna-Lab) : Kit, 14 ayrı mutasyonun kı sa sürede taranmaqsını sağlamaktadır. Kite ait pro­ sedür içinde DNA ekstraksiyonu, PCR, hibridizas yon ve renklendirme reaksiyonu yer almaktadır. Kitten çıkan DNA ekstraksiyon çözeltileri kullanıla rak elde edilen genomik DNA, yine kitin içinde bu­ lunan PCR amplifikasyon mixleri ile karıştırılarak PCR multipleks reaksiyonuna sokulur ve reaksiyon sonucu biyotinlenir. Sonuç olarak PCR ürünü strip üzerinde bulunan immobilize mutant ve normal oligonükleotid problar ile hibridize edilir. Bağlanan biyotinli diziler streptavidin-alkalen fosfataz ve renklendirme substratları kullnılarak belirlenir. Hastaya ait DNA'da taranan mutasyonlardan biri var ise analiz sonucunda strip üzerinde mevcut mutant prob bölgesinde bir renk belirir. Normal probların bağlı olduğu bölgelerde ise mutasyonsuz normal alleller bağlanır.
1. Restriction Fragment Length Polymorphisms; Restriksiyon Parça Uzunluğu Polimorfizmleri (RFLPs) : Hastalığa neden olan mutasyonların tanımlanmadığı durumlarda aile içinde hastalık ile birlikte kalıtılan allelin dolaylı bir yak­ laşım kullanılarak tespit edilmesidir DNA polimorfizmleri, DNA üzerinde, hastalığa neden olmayan nükleotid değişimleri olarak tanım­lanır. Bu doğal farklılıklar kuşaktan kuşağa Mendel yasalarına göre aktarılırlar. Eğer bu polimorfizmler, bir restriksiyon enzimi kesme bölgesinin yok olma­sına ya da yeniden oluşmasına neden olursa kolay lıkla saptanabilirler. DNA, bu enzim ile kesildiğin­de farklı uzunlukta parçalar oluşur.
DNA polimor fizmlerinin bulunduğu bölgeleri PCR yöntemi ile çoğaltmanın mümkün olması, bir bölgenin kolay­ lıkla jel elekroforezi ile doğrudan analizine olanak sağlamıştır. Restriksiyon parça uzunluğu polimor­ fizmleri (RFLP) kalıtsal hastalıkların penatal tanı ve taşıyıcılık tanısında yaygın olarak kullanılmaktadır.
RFLP analizinin temeli, anne ve babanın iki ay­ rı alleli taşıyan iki kromozomun birbirinden ayırdedilmesine ve aile içinde daha önceden bulunan hasta bir çocuk yardımı ile hangi kromozomların riskli olduğunun, yani hangi kromozomun mutas- yona uğramış alleli (bozuk geni) taşıdığının saptan masına dayanır. RFLP analizinde, iki kromozom birbirinden, gen içinde veya gen yakınında bulu nan bir DNA polimorfizminin bulunması (+) ya da bulunmaması (-) ile ayrılır.
Analizin kesinliği kullanılan polimorfik markörün, hastalık loküsüne yakınlığı ile doğrudan ilişkilidir. Hastalık loküsüne mümkün olduğunca yakın gen içi markörlerin kullanımı tanının kesinliğini %100'e kadar arttırır. Hastalığa neden olan genin, DMD/BMD'de olduğu gibi, çok büyük olması du­ rumunda ise, gen içi markörler kullanılsa bile tanı­ nın kesinliği %95 civarındadır. Kullanılan genetik markör ve hastalık loküsü birbirinre ne kadar ya­ kınsa rekombinasyon olasılığı o kadar küçüktür.
X kromozomuna bağlı olarak seyreden kalıtsal hastalıklarda RFLP analizinin uygulanabilmesi için ön koşul annenin herhengi bir polimorfizm için informatif (+/-) olmasıdır. Otozomal kalıtsal hastalık­larda ise, RFLP analizinin uygulanbilmesi için hem annenin hem de babanın informatif bulunması ve riskli kromozomların belirlenmesi gerekmektedir. Riski kromozomun belirlenmesinde ise, daha önce dünyaya gelmiş hasta ve sağlıklı çocukların analizi ve hatta bazı durumlarda yakın akrabalarıda içe­ren detaylı aile analizi gereklidir.
RFLP analizi, özellikle hastalığın kalıtsal olarak kuşaktan kuşağa geçtiği bilinen durumlarda kolay lıkla taşıyıcı tanısı için kullanılabilmektedir. Sporadik olgularda ise taşıyıcı tanısı dikkatle verilmelidir.
2. Variable Nutnber of Tandem Repeats; Değişken Sayıda Tandem Tekrarları (VNTRs) : Dolaylı bir yaklaşım kullanılarak prenatal tanı ve taşıyıcılık tanısı verilmesinde kullanılan bir yön­temdir. VNTR yönteminde kullanılan DNA poli­ morfizmleri, farklı sayılardaki tandem tekrarlandır. Her tandem tek bir birim olarak ele alınır. PCR için kullanılan primerler, bu birimi sınırlayacak nükle­ otid dizisine sahiptir. PCR sonucu oluşan ürünlere jel üzerinde bakarak birim sayısından kaynaklanan uzunluk farkına göre allel geçiş durumu tespit edi­ lebilmektedir. RFLP analizinde olduğu gibi, X kro­mozomuna bağlı olarak seyreden kalıtsal hastalık­larda VNTR analizinin uygulanabilmesi için ön ko­şul annenin herhangi bir polimorfizm için informa­tif olmasıdır. Otozomal kalıtsal hastalıklarda ise, VNTR analizinin uygulanbilmesi için hem annenin hem de babanın informatif bulunması ve riskli kro­mozomların belirlenmesi gerekmektedir.
Sonuç
Özetle, bugüne kadar Düzen Laboratuvarı Moleküler Biyoloji Ünitesi, proje kapsamında başlatıl mış olan hastalıklarda var olan rutin analiz yöntem­ lerinin uygulamaya sokulması, gerek hasta aileleri ne gerekse doktorlara en kısa zamanda sonuç ve­ rilmesi ve genetik danışma zincirinde üzerine dü­şen görevi en doğru şekilde yerine getirebilmesi için gerekli disiplini kurmuş ve 1996 senesinden bu yana bu displini korumuştur. Bununla birlikte, kalıtsal hastalıkların yukarıda bahsi geçenlerle sı­nırlı kalmadığının ve toplum sağlığı için tehdit oluşturan daha birçoklarının olduğunun bilincindedir. Bu sebeple amacımız, araştırma kapsamında yapılması gereken çalışmaların laboratuvarımız bünyesinde gerçekleştirilebilmesi için yeni, duyarlı ve hızlı DNA analiz yöntemlerini uygulamaya sok­maktır ve çalışma spektrumumuzu genişletmektir.

 
Kaynaklar
1. National Center for Biotedınology Information (NCBI); On­ line Mendelian Inheritance in Man (OMIM); HYPERLINK http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Omim/disp- mim?219700.
2. Cyctic f'ibrosis Mutation Database at HYPERLINK http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/
3. Lissens W, Liebaers I: The genetics of male infertility in re- lation to cystic fibrosis. Baillieres Clin Obstet Gynaecol, 1997; 11: 797-817.
4. Costes B, Girodon E, Ghanem N et al: Frequent occurrence of the CFTR intron 8 (TG)n 5T allele in men with congeni tal bilateral absence of the vas deferens. EurJ Hum Genet, 1995; 3: 285-93.
5. Onay T, Topaloglu O, Zielenski J et al: Analysis of the CFTR gene in Turkish cystic fibrosis patients: identification of three novel mutations (3172delAC, P1013L and M1028I). Hum Genet, 1998; 102: 224-30.
6. National Center for Biotedınology Information (NCBI); On­ line Mendelian Inheritance in Man (OMIM); HYPERLINK http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Omim/disp mim?141900
7. Huisman THJ, Carver MFH, Baysal E: A Syllabus of Thalas semia Mutations (1997), The Sickle Celi Anemia Foundation, Augusta, USA, 1997.
8. Çavdar A, Arcasoy A: The Incidence of P-Thalassaemia and Abnormal Hemoglobin in Turkey," Açta Haematologica, 1971; 45:312-8.
9. Tadmouri GO, Tüzmen S, Ozçelik H et al: Molecular and Population Genetic Analyses of fJ-Thalassemia in Turkey. Am J Hem, 1998; 57:215-20.
10. National Center for Biotedınology Information (NCBI); On­ line Mendelian Inheritance in Man (OMIM); HYPERLINK http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Omim/disp mim?2533OO
11. National Center for Biotechnology Information (NCBI); On­line Mendelian Inheritance in Man (OMIM); HYPERLINK http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Omim/disp mim?253550
12. National Center for Biotechnology Information (NCBI); On­line Mendelian Inheritance in Man (OMIM); HYPERLINK http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Omim/disp mim?2534OO
13. Melki J, Sheth P, Abdelhak S et al: Mapping of acute (type I) spinal muscular atrophy to chromosome 5ql2-ql4. The French Spinal Muscular Atrophy Investigators. Lancet, 1990; 336:271-3.
14. Gilliam TC, Brzustowicz LM, Castilla LH et al; Genetic ho mogeneity between acute and chronic forms of spinal mus cular atrophy. Nature, 1990; 345:823-5.
15. Lefebvre S, Burglen L, Reboullet S et al: Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Celi, 1995; 80:155-65.
16. Roy N, Mahadevan MS, McLean M et al: The gene for neuro nal apoptosis inhibitory protein is partially deleted in individuals with spinal muscular atrophy. Celi, 1995; 80:167-78.
17. Savaş S. The Molecular Analysis of SMA in Turkish Popula tion. PhD Thesis, 1999.
18. National Center for Biotedınology Information (NCBI); On­ line Mendelian Inheritance in Man (OMIM); HYPERLINK http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Omim/disp mim?227400
19. Alhenc-Gelos M, Gandrille S, Aubry ML et al: Unexplained thrombosis and factor V Leiden mutation. Lancet, 1994; 344:555-6.
20. National Center for Biotechnology Information (NCBI); On­ line Mendelian Inheritance in Man (OMIM); HYPERLINK http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Omim/disp- mim?263200
21. Guay-Woodford LM, Muecher G, Hopkins SD et al: The se­vere perinatal form of autosomal recessive polycystic kidney disease maps to chromosome 6p21.1-pl2: implications for genetic counseling. Am J Hum Gene, 1995; 56:1101-7.
22. Zerres K, Mucher G, Bachner L, Deschennes G et al: Map­ping of the gene for autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD) to chromosome 6p21-cen. Nat Genet, 1994; 7:429-32.
23. Zerres K, Mucher G, Becker J et al. Prenatal diagnosis of au­tosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD): mole­ cular genetics, clinical experience, and fetal morphology. Am J Med Genet, 1998; 76:137-44.
24. National Center for Biotechnology Information (NCBI); On­ line Mendelian Inheritance in Man (OMIM); HYPERLINK http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Omim/disp mim? 100800
25. National Center for Biotechnology Information (NCBI); On­ line Mendelian Inheritance in Man (OMIM); HYPERLINK http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Omim/disp mim?310200
26. Scriver CR, Beaudet AL, Siy WS, Valle D: Metabolic and mo­ lecular basis of inherited disease. 7th ed. Wiley-Liss Inc., 1997; p.4199.
27. Bartlett RJ, Pericak-vance MA, Koh J. et al. Duchenne mus­ cular dystrophy: high frequency of deletions. Neurol. 1988; 38, 1-4.
28. Hu X, Burghes AHM, Ray PN et al: Partial gene duplications in Duchenne and Becker muscular dystrophies. J. Med. Ge­ net, 1988; 25, 369-76.
29. National Center for Biotechnology Information (NCBI); On­ line Mendelian Inheritance in Man (OMIM); HYPERLINK http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Omim/disp mim?306700
30. National Center for Biotechnology Information (NCBI); On­ line Mendelian Inheritance in Man (OMIM); HYPERLINK lıttp:// www.ncbi.nlm. nih.gov/htbin-post/Omim/disp mim?306900
31. Tuddenham EG, Schwaab R, Seehafer J et al: Haemophilia A: database of nucleotide substitutions, deletions, insertions and rearrangements of the factor VIII gene, second edition. Nucleic Acids Res, 1994; ll;22:4851-68.
32. The Haemophilia A Mutation, Structure, Test and Resource Site; HYPERLINK http://europium.mrc.rpms.ac.uk/usr/ WWW/WebPages/main.dir/main,htm Turkish Human Mutation Database HYPERLINK lıttp:// bucmpe.cmpe.boun.edu.tr/hmuttr/hemb.htm.
33. Turkish Human Mutation Database HYPERLINK lıttp:// bucmpe.cmpe.boun.edu.tr/hmuttr/hemb.htm
Dosya / Açıklama
Tablo 1.
Moleküler Genetik Birimin'de Rutin Çalışma Kapsamında Olan Mutasyonlar
Tablo 2
Moleküler Biyoloji Unitesi'nde Rutin Çalışma Kapsamında Kullanılan Bağlantı Analiz Marlcörleri